技术原理

双分子荧光互补（Bimo-lecular fluorescence complementation，简称BiFC），将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-fragment、C-fragment），将这两个荧光蛋白的片段分别融合两个目标蛋白A、B，如果A与B蛋白发生了相互作用，在空间上互相靠近，就会重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，在激发光的激发下，荧光蛋白发出荧光。反之，若A与B蛋白之间没有相互作用，则不能被激发岀荧光。

应用场景

 验证蛋白质之间是否存在相互作用，可与酵母双杂、Co-IP等实验结果相互验证；

技术优势

1. 适用于体内和体外蛋白相互作用的验证；
2. 实验中的蛋白处于天然状态，并能直观观察蛋白相互作用在细胞中的定位；实验周期短；
3. 相对于FRET和BRET技术对仪器的要求高、数据处理复杂的情况，BiFC只需要荧光倒置显微镜，数据处理简单，只检测荧光的有无，背景干净，检测更灵敏，不依赖于其他次级效应；
4. 还可以用于研究蛋白之间的弱相互作用或瞬间相互作用；
5. 不需要蛋白有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白间的相互作用

技术步骤

1. 植物材料以及菌株的保存与培养

2. 基因克隆及重组质粒的构建

3. 大肠杆菌***0感受态的制备和转化

4. 农杆菌GV3101感受态的制备和转化

5. 农杆菌介导的瞬时表达体系

6. 烟草叶片荧光检测

送样指南

虚拟样品： 需要提供两个蛋白质的CDS序列信息，

实体样品：

服务内容

服务说明

1. 本实验默认在烟草中进行。

2. 阳性对照组有荧光，而阴性对照无，则认为对照组正常，实验成功。

3. 若阳性、阴性对照正常，且实验组检测到荧光则认为两个蛋白互作。

案例展示

以A-nYFP与cYFP、nYFP与B-cYFP组合作为阴性对照，排除载体的影响，结果表明A与B互作，并且发生在细胞核中。

图1 A与B在烟草中的互作情况

参考文献

1. Wenyuan Ruan,Meina Guo,Xueqing Wang, et al. Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice. Molecular Plant. 2019;12 (8):1060-1074.

2. Brett Burdo,John C. Gray,M. Paula Goetting-Minesky, et al. The Maize TFome – development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 2014;80 (2):356-366.

3. Bin Ou,Kangquan Yin,Sai-Nan Liu, et al. A High-Throughput Screening System for Arabidopsis Transcription Factors and Its Application to Med25-Dependent Transcriptional Regulation. Molecular Plant. 2011;4 (3):546-555.